Complicanze

La rigenerazione delle cellule ß del pancreas

Di Massimo Trucco (*) -Traduzione a cura di Linda Possanzini

(*) Division of Immunogenetics, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, Children’s Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.

Riassunto

Il diabete di tipo 1 è la conseguenza di un attacco di tipo autoimmune contro le cellule ß del pancreas endocrino responsabili della produzione d’insulina. L’attuale terapia del diabete di tipo 1 si basa su rigorose ed invasive misurazioni dei livelli di glucosio nel sangue da effettuarsi più volte al giorno insieme ad iniezioni sottocutanee d’insulina derivata da DNA ricombinante. Il trapianto d’isole pancreatiche, anche se in questi ultimi anni ha fornito importanti risultati, non è ancora indicato per i pazienti in età pediatrica. Tuttavia, grazie alla scoperta delle capacità rigenerative del pancreas endocrino ed ai risultati di alcune recenti ricerche che hanno mostrato che le linee cellulari ES (staminali embrionali) possono essere ricreate in vitro, quest’articolo discuterà se sia pratico o persino possibile combinare queste linee di ricerca con un trattamento più efficace per i giovani pazienti diabetici.
Nei vertebrati, il processo di gastrulazione avviene molto precocemente durante lo sviluppo dell’embrione. La gastrulazione consta di una serie di movimenti cellulari che portano all’identificazione dei 3 foglietti embrionali: l’ectoderma, l’endoderma, ed il mesoderma. Dall’ectoderma si formano l’epidermide ed il sistema nervoso centrale; dal mesoderma derivano i muscoli, il sistema circolatorio e le ossa; mentre dall’endoderma derivano l’apparato digerente e quello respiratorio. L’endoderma embrionale, assumendo la forma d’intestino allo stadio primitivo, funge da architrave per l’apparato gastrointestinale da cui ha infine origine il pancreas embrionale. è stato dimostrato che la morfogenesi dell’abbozzo pancreatico da origine ai dotti ed alle cellule acinari della ghiandola. I progenitori endocrini, riproducendosi dai dotti abbozzati, formano poi aggregati di cellule differenziate note con il nome di cellule di Langerhans. Mentre gli acini pancreatici, composti da cellule responsabili della secrezione nell’intestino degli enzimi che prenderanno poi parte al processo digestivo del cibo ingerito, costituiscono la componente esocrina della ghiandola; le isole pancreatiche, invece, sono composte da 4 popolazioni cellulari, organizzate in un ordine topologico stereotipato, e costituiscono la componente endocrina della ghiandola. Nelle isole, le cellule ? producono il glucagone, le cellule ß, l’insulina; le cellule ?, il polipeptide pancreatico; e le cellule ? la somatostatina.
è proprio grazie a questa conoscenza dell’embriogenesi pancreatica se si ritiene che i progenitori endocrini pancreatici residui, che garantiscono l’omeostasi insulare, siano presenti nei dotti pancreatici della ghiandola adulta. L’identificazione e la caratterizzazione di questi progenitori putativi è di fondamentale importanza, non solo per una miglior comprensione della fisiopatologia pancreatica, ma anche per lo sviluppo di potenziali approcci terapeutici derivanti da un loro utilizzo corretto.
Il diabete di tipo 1 è la conseguenza clinica della distruzione delle cellule ß del pancreas responsabili della produzione d’insulina, mediata dalle cellule T autoreattive dirette contro i determinanti delle cellule ß. La distruzione della gran parte della popolazione delle cellule ß, condizione evidente alla comparsa della malattia, comporta una terapia a base d’iniezioni sottocutanee giornaliere di dosi d’insulina che dovranno essere proporzionali alla quantità di glucosio presente nel sangue al momento dell’iniezione. La sostituzione fisica delle cellule ß costituisce il fondamento logico per cui il trapianto d’isole fu originariamente proposto da Paul Lacy. Sebbene recentemente sia stato dimostrato che i trapianti d’isole pancreatiche possono essere eseguiti con grandi probabilità di successo rispetto ad alcuni anni fa, le limitazioni sono ancora troppo numerose per permettere una vasta applicazione di questa procedura come cura definitiva del diabete. La terapia immunosoppressiva necessaria per proteggere le isole da una continua risposta autoimmune e dall’allorigetto, può, col passare del tempo, provocare un danno renale irreversibile, mentre il processo stesso d’isolamento delle isole, sebbene migliorato negli ultimi anni, danneggia le isole trapiantate e, di conseguenza, sono necessari da due a tre donatori per ottenere la massa cellulare minima indispensabile per un solo trapianto.
Alla luce di queste recenti scoperte che evidenziano le capacità rigenerative del pancreas endocrino e la derivazione in vitro delle linee cellulari umane ES, dobbiamo considerare possibili alternative al trapianto d’isole allogeniche.

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Esiste realmente quest’elusiva cellula staminale pancreatica?

Negli umani, è presente una cellula staminale, nota come cellula totipotente, legata ad uno specifico lineage cellulare capace di dare origine a tutti i tipi di tessuti e cellule differenziate, compresi i tessuti extraembrionali. Lo zigote dei mammiferi è considerato per antonomasia la cellula staminale totipotente più importante. Tuttavia, nell’utero, questa cellula staminale continua a divedersi fino a diventare un amalgama di cellule figlie simili, ma non identiche. Non è noto ancora come sia possibile distinguere tra queste cellule figlie quelle poche che continuano a preservare la loro capacità di rigenerare l’intero, multivariato, prodotto finale – ammesso che queste cellule totipotenti esistano realmente. Di conseguenza, non abbiamo ancora a disposizione dei marker specifici in grado di caratterizzare la cellula totipotente. Una volta che i vari tessuti ed organi cominciano a formarsi, non sappiamo se tutte le cellule totipotenti vengano preservate con loro e, se lo sono, per quanto tempo ancora conservino la loro funzionalità. Ad intuito, possiamo sostenere che alcuni tipi di precursori siano presenti ed attivi nel nostro corpo per tutta la vita, poichè anche nelle persone anziane le lesioni ai tessuti vengono riparate, anche se con minor efficienza. Tuttavia, non sappiamo ancora dove queste ipotetiche cellule precursori possano nascondersi e quali cellule differenziate finali possano realmente generare.
Teologicamente, il nostro sistema rigenerativo dovrebbe essersi sviluppato secondo la stessa logica per cui le stazioni dei pompieri dovrebbero essere collocate per tutta la città in modo tale che ogni unità possa essere in grado di raggiungere nel minor tempo possibile la zona dell’incendio e d’intervenire efficientemente. In altre parole, in ogni organo dovrebbero essere schierate non necessariamente delle cellule totipotenti, ma almeno dei precursori con capacità di automantenimento, come anche quelli necessari per rimpiazzare le cellule ormai distrutte. Questi precursori dovrebbero essere in grado di sostenere un processo che, mentre procede in modo relativamente lento nel mantenimento dell’omeostasi tissutale, dovrebbe essere convertito, in caso di crisi, in un sistema operativo rapido. Di conseguenza, questo sistema risulterebbe molto efficace nel rispondere prontamente a più stimolazioni, favorite dai resti microstrutturali dei tessuti distrutti, dai metaboliti di processi che producono energia, dai fattori di crescita peptidica, etc. Fisiologicamente, nel pancreas endocrino, le cellule che producono insulina, giunte ormai alla fine del loro ciclo vitale, dovrebbero essere, sebbene molto lentamente, rimpiazzate da cellule di nuova origine. Tale processo rigenerativo dovrà essere approfondito ulteriormente se si vorranno trarre dei vantaggi per scopi terapeutici.
Considerando quanto le cellule staminali risultino utili nel processo di rigenerazione delle cellule ß del pancreas, dobbiamo porci qualche quesito: nel pancreas endocrino adulto, i progenitori multipotenti esistono realmente? Se si, dove si trovano esattamente? Quali sono i migliori marker per riconoscerli ed isolarli? Quali sono gli stimoli capaci di attivare i loro percorsi di differenziazione? In assenza dei progenitori pancreatici, ci sono delle cellule staminali pluripotenti – cellule non connesse ad uno specifico lineage che possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule e tessuti, fatta eccezione per i tessuti extraembrionali – che si trovano in altre parti del corpo in grado di rigenerare la massa cellulare ß? Se queste cellule sono tutti precursori collegati al lineage, possiamo invece utilizzare le linee cellulari ES ottenute in vitro per sostituire le cellule ß del pancreas distrutte?

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La strada per la rigenerazione

La massa ß cellulare può aumentare attraverso un incremento della replicazione e delle dimensioni delle cellule ß, come anche grazie ad una minore mortalità delle cellule ß, ed alla differenziazione d’eventuali progenitori delle cellule ß esistenti. è stato dimostrato che occasionalmente delle cellule endocrine possono trovarsi nei dotti pancreatici. Tuttavia, queste cellule sono poche e lontane tra loro. Nei soggetti obesi o durante la gravidanza il numero di queste cellule endocrine associate ai dotti aumenta fisiologicamente a causa di una grave resistenza all’insulina. Simili modificazioni istologiche sono state osservate in caso di lesioni ai tessuti o guarigione dopo una pancreatomia parziale, legatura dei dotti, o sovraespressione IFN-? guidata dal fattore di crescita insulinico. Anche in seguito, nei dotti, solo un piccolo numero di cellule diventa positivo all’insulina. Ciò suggerisce che anche se esistono alcuni ipotetici precursori, il processo di formazione delle cellule endocrine fuori dalle isole (neogenesi) non è una proprietà dell’epitelio dei dotti riscontrata di frequente. D’altra parte, il fatto che le cellule ? e ß si sviluppino da un probabile, non espressione dell’ormone, comune precursore ancora positivo Pdx-l suggerisce che tutti i tipi di cellule trovati all’interno delle isole possono originare da un comune progenitore endocrino. Questi progenitori endocrini si possono trovare vicino al dotto ma non fanno parte dell’epitelio duttale. Le cellule progenitrici potrebbero essere mesenchimali in origine, o si potrebbero trattare di cellule differenziate da un tipo di cellula sconosciuta. Se il numero di queste progenitrici è estremamente basso, l’analisi del lineage diventerebbe molto difficile per la mancata conoscenza di marker appropriati. Inoltre, se queste cellule sono così rare come sembrano, diventa difficile quantificare il loro contributo al normale ricambio cellulare endocrino.
Queste sono solo alcune delle conclusioni a cui sono giunti Weir e Bonner-Weir nel commentare lo studio condotto da Seaberg et al. in cui era stato mostrato come singole cellule precursori pancreatiche murine adulte potevano generare una progenie con caratteristiche tipiche a quelle delle cellule pancreatiche, incluse le cellule ß. Questi rari (1 ogni 3,000-9,000 cellule) precursori multipotenti derivati dal pancreas (PMPs) non sembrano essere realmente delle cellule ES pluripotenti, poichè non presentano, per esempio, i marker di staminalità Oct 4 e Nanog responsabili della moltiplicazione delle cellule indifferenziate ES; nè hanno un’origine chiaramente ectodermica, mesodermica o endodermica, non esprimendo altri marker considerati specifici per i precursori di ognuna delle cellule embrionali. Visto che, sorprendentemente, questi PMPs non presentavano nè nessun marker delle cellule ß (es. HNF3 ß) nè nessun marker dell’epitelio duttale (es. citocheratina), ma erano tuttavia in grado di generare prodotti differenziati con caratteristiche neurali e cellule pancreatiche ?, ß, ? e cellule acinari, l’autore avanzò l’ipotesi dell’esistenza di una nuova ed unica cellula precursore ectodermica/endodermica presente durante lo sviluppo embrionale che permane nei tessuti adulti.
Questi risultati supportano le conclusioni di un altro recente studio in cui i progenitori pancreatici multipotenti sono stati isolati prospetticamente utilizzando una separazione delle cellule tramite citometria a flusso. Il marker utilizzato in questo caso era il recettore c-Met, e l’HGF. Il motivo di questa scelta era dovuto allo scambio di segnale tra le cellule epiteliali e quelle mesenchimali, che favorisce l’interazione tra il c-Met e l’HGF, e gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo del pancreas. Gli autori affermano che l’interazione tra il recettore c-Met e l’HGF è responsabile della crescita e della differenziazione delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche non solo durante lo sviluppo ma anche durante la fase adulta, dove mantengono l’omeostasi e favoriscono la rigenerazione. Si è visto che delle colonie derivate da singole cellule c-Met - positive, prelevate dai tessuti pancreatici di topi adulti e appena nati, contenevano cellule che esprimevano diversi marker di lineage cellulari endocrini, acinari, e duttali. Mentre i marker neuroectodermici non sono stati presi in considerazione, le cellule staminali pancreatiche isolate nello studio condotto da Suzuki et al. hanno anche generato delle cellule che esprimevano marker di cellule gastrointestinali ed epatociti, probabilmente dovute alla selezione dei marker utilizzati. Le cellule PMP-derivate erano invece cresciute in vitro senza il siero normalmente utilizzato per la coltura delle cellule staminali neurali.
Tutti questi studi, anche se con esiti divergenti, sembrano supportare la conclusione per cui esistono nel pancreas delle cellule precursori endocrine. Queste sono presenti non solo nei dotti, ma anche nelle isole stesse, poichè sono state utilizzate indipendentemente entrambe le sottopopolazioni come fonte dei singoli precursori cellulari isolati. Da un lato, questa conclusione supporta l’ipotesi di lavoro di coloro che sostengono che le cellule pancreatiche duttali possono transdifferenziarsi in cellule ß e che si tratta di un processo fisiologico generalmente attivato più efficientemente da un’aumentata domanda metabolica e dalle lesioni ai tessuti.; dall’altro lato, può anche supportare i risultati più recenti ottenuti da Dor e colleghi, che affermano al contrario che nessuna cellula ß può avere origine da cellule progenitrici non ß, sia in un pancreas adulto sano che dopo una pancreatomia. Come diretta conseguenza, il numero delle cellule ß dovrebbe essere ad un certo punto virtualmente definito, e, successivamente, la glicemia dovrebbe essere controllata solo da questo pool cellulare definito. I risultati dello studio di Dor sono stati ottenuti utilizzando un sofisticato sistema Cre/Iox che, nei topi transgenici, può essere indotto dal tamoxifene. Questo sistema classifica le cellule ß completamente differenziate che esprimono la proteina della fosfatasi alcalina umana, che è a sua volta rivelata da un colorante istochimico. In un periodo di tempo definito, la “caccia”, solo le cellule che discendono da cellule ß già esistenti e classificate vengono riclassificate. Nuove cellule ß derivate da qualsiasi fonte di cellule non ß, incluse le cellule staminali, non vengono classificate. La frequenza e la distribuzione delle cellule ß classificate nelle isole pancreatiche, al termine del periodo di caccia, dovrebbe essere inversamente proporzionale al numero delle cellule nuove non classificate presenti nelle stesse strutture. Se la frequenza delle cellule classificate non varia, come osservato, il numero di cellule derivate dalla differenziazione dei precursori che non producono insulina dovrà essere minimo o nullo, mentre alla fine le cellule ß differenziate che producono insulina dovrebbero essere le cellule che proliferano realmente e danno origine ad altre cellule ß producenti insulina. Mentre i risultati di Seaberg et al. non contestano la provata capacità sebbene limitata di una cellula ß di divedersi, l’insuccesso di Dor di osservare le cellule probabilmente differenziate da cellule staminali o precursori potrebbe essere dovuta sia al numero estremamente limitato sia a problemi tecnici. Per esempio, l’uso del tamoxifene iniettato intraperitonealmente o per via sottocutanea due volte alla settimana per un periodo di due settimane e mezzo potrebbe aver bloccato la neogenesi dalle cellule precursori in particolar modo nei dotti pancreatici adiacenti alle isole involute, come osservato da Pelengaris et al., e una volta interrotta la somministrazione del tamoxifene, queste cellule potrebbero non avere avuto tempo sufficiente per differenziarsi.

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Come limitare la risposta autoimmune

Su queste basi, possiamo concludere che i precursori di un tipo probabilmente non convenzionale possono trovarsi sia nelle strette vicinanze che all’interno del tessuto endocrino e possono essere attivati da una aumentata richiesta metabolica o da fattori secreti ancora sconosciuti, normalmente capaci di accelerare il processo che in condizioni normali garantisce l’omeostasi delle Isole di Langerhans. L’equilibrio fisiologico tra le cellule distrutte e quelle appena generate può essere alterato dall’azione delle cellule T autoreattive nel momento in cui si sviluppa l’autoimmunità. Una volta che la cellula T distrugge l’attività sopraggiunge l’attività compensatrice dell’organo, il numero delle cellule ß funzionanti diminuisce progressivamente fino a diventare troppo esiguo perchè mantenga l’omeostasi glucidica di tutto il corpo. Il tempo di transizione oltre questa soglia metabolica diventa immediatamente chiaro con la comparsa dei sintomi caratteristici della manifestazione clinica del diabete di tipo I. Durante il corso della malattia, anche se le proprietà rigenerative del pancreas rimangono funzionanti, la presenza continua delle cellule T autoreattive diabetogene annulla in modo consistente lo sforzo riparativo. Il fatto che queste cellule T autoreattive restino presenti nel corpo del soggetto diabetico per un lungo periodo è provato da esperimenti dove le isole sane trapiantate in topolini diabetici singenici a lungo termine o negli umani venivano rapidamente distrutte da queste stesse cellule T autoreattive.
La risposta autoimmune viene evitata con successo nei topi NOD (topi diabetici non obesi) sia attraverso l’eliminazione di gran parte delle cellule T autoreattive per mezzo d’anticorpi anti-cellule T sia attraverso la sostituzione di tutte o di una parte del repertorio cellulare immunocompetente con delle cellule del midollo osseo prelevate da donatori resistenti al diabete.
In uno studio di Ogawa et al., il trattamento dei topolini Nod con un siero antilinfocitario (ALS) annullò l’autoimmunità ma raggiunse solamente una remissione clinica parziale. Il trattamento transitorio dei topolini NOD con ALS ed exendin-4, un potente ormone insulinotropico che favorisce la replicazione e la differenziazione delle cellule ß in vitro e in vivo, diede luogo invece ad una completa remissione nell’88% degli animali trattati in 75 giorni, accompagnato da una progressiva normalizzazione della tolleranza al glucosio, una migliore istologia insulare, da un aumentato contenuto d’insulina nel pancreas, ed un normale rilascio insulinico in presenza di glucosio. Questi risultati mostrano che l’exendin-4 aumenta l’effetto che induce la remissione dell’ALS, probabilmente favorendo la differenziazione dei precursori delle cellule ß.
Anche, l’induzione di un chimerismo allogenico miscelato ottenuto dopo aver trapiantato midollo osseo prelevato da donatori resistenti al diabete in animali diabetici, dopo essere stati sottoposti ad una dose sottoletale d’irradiazioni, si è dimostrato sufficiente per bloccare ed eventualmente far regredire l’invasione e l’infiammazione sistemica delle isole pancreatiche da parte delle cellule T autoreattive che da poi luogo ad un’insulite. Nel pancreas endocrino, una volta eliminata questo pericolo per l’immunità, il processo fisiologico della rigenerazione può proseguire efficientemente, rifornendo la popolazione delle cellule che producono insulina in numero sufficiente da mantenere un’euglicemia, e guarendo così il recipiente diabetico. Mentre questo processo ha luogo – e non è ancora chiaro se avvenga per settimane o mesi- la glicemia del recipiente deve essere controllata attraverso ulteriori misure indipendenti. La tecnica più utilizzata consiste nel trapiantare nel recipiente isole prelevate dallo stesso donatore di midollo osseo. Tuttavia, il riuscito attecchimento del midollo osseo trapiantato, dovrebbe essere mantenuto senza l’uso di farmaci immunosoppressori. Questi potenti farmaci possono uccidere non solo le cellule T autoreattive del recipiente ancora presenti, ma anche le stesse cellule ß, annullando così lo scopo del trapianto. L’uso dei farmaci immunosoppressori può anche interferire con l’innalzamento osservato delle cellule T regolative.
Un attuale punto di discussione è se solo il midollo osseo trapiantato o anche le cellule ß cotrapiantate siano necessari per favorire un efficiente processo rigenerativo, indipendente della loro capacità di bloccare l’autoimmunità o preservare l’euglicemia. Possono, ad esempio, secernere fattori come peptidi simili al glucagone, utili per sostenere un efficiente processo rigenerativo. Alcuni dati certi suggeriscono che i precursori emopoietici presenti nella popolazione cellulare del midollo osseo non partecipano direttamente al processo riparativo delle cellule che producono insulina. Nel recipiente curato, le cellule che producono insulina che sono geneticamente marcate per indicare che hanno origine dal donatore sono estremamente rare, verificandosi in non più di 2 su più di 100.000 cellule ß. Queste cellule possono essere il risultato di sporadici processi di fusione cellulare. Una diversa fonte di cellule, per esempio, la milza, potrebbe essere in grado di bloccare l’autoimmunità e di fornire anche precursori di cellule ß mesenchimali. Tuttavia, l’ipotizzata presenza nella milza dei topi di cellule mesenchimali embrionali è tuttora da confermare.

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Ulteriori quesiti

Anche quando la rigenerazione delle cellule ß da cellule precursori è provata in modo certo, restano tuttavia da risolvere alcuni problemi quali le condizioni fisiologiche e lo spazio di tempo necessario perchè avvenga la rigenerazione e riesca a raggiungere il suo completamento, come anche le circostanze che limitano o favoriscono tale processo rigenerativo e la capacità dei medici di favorire od evitare queste, per raggiungere in modo più efficiente i risultati terapeutici desiderati. Anche, ammettendo l’esistenza dei precursori delle cellule ß, non sappiamo ancora se queste cellule siano immortali o soggette alla senescenza, una condizione che lascerebbe un lasso di tempo troppo piccolo per intervenire. Questo fatto può rivelarsi determinante nei soggetti diabetici in cui il processo di riparazione è stato represso per un lungo periodo di tempo da una sorveglianza autoimmune. Se subito dopo la manifestazione clinica della malattia non può essere iniziato un processo immunoregolatorio valido, la completa ripresa della funzionalità endocrina della ghiandola attraverso la rigenerazione fisiologica potrebbe risultare impossibile. Tuttavia, se ad un certo punto il processo rigenerativo è dichiarato irreversibilmente compromesso, può ancora essere possibile trapiantare delle cellule precursori funzionanti prelevate da donatori non diabetici nei soggetti diabetici o delle cellule del paziente stesso convertite artificialmente da altri tessuti o lineage in cellule ß che producono insulina.

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Il potenziale delle cellule ES

Anche se sono disponibili marker specifici indispensabili per riconoscere i precursori delle cellule ß, l’isolamento fisico di queste cellule prelevate dal pancreas di un paziente non è un’operazione tra le più semplici. Aumentare il numero dei precursori ex vivo evitando l’attivazione dei percorsi di differenziazione è altrettanto problematico, visto che si tratterebbe alla fine di facilitare la loro differenziazione verso il prodotto finale, in questo caso, una cellula ß funzionale. Si è, inoltre, visto che coltivare e crescere le cellule ß in vitro è altrettanto difficile e probabilmente limitato a pochi cicli proliferativi, poichè si tratta alla fine di cellule differenziate. Ci si è domandato se sarebbe più facile far derivare le cellule precursori dall’embrione e utilizzarle per rigenerare il pancreas danneggiato. Sebbene le linee cellulari ES siano state create con successo, e di recente rese disponibili alla comunità scientifica, la necessità di guidare la loro differenziazione verso un prodotto finale specifico, in questo caso la cellula ß, resta tuttora il maggior problema da risolvere.
La cellula staminale è, per definizione, l’unica cellula capace di duplicarsi e di riprendere il suo stato indifferenziato, creando anche una progenie in grado di differenziarsi in uno o più prodotti finali definiti fisiologicamente dalle loro funzioni specifiche. Procedendo attraverso il percorso di differenziazione, le cellule staminali possono essere classificate come totipotenti, pluripotenti, multipotenti, oligopotenti e unipotenti, a seconda delle loro caratteristiche di reversibilità acquisite progressivamente
Le cellule ES sono linee cellulari pluripotenti derivanti dalla massa cellulare interna degli embrioni allo stadio blastocistico, e la loro differenziazione in coltura può riprodurre le caratteristiche dello sviluppo embrionale precoce. In base alle similarità tra i meccanismi che controllano lo sviluppo sia del pancreas adulto che del sistema nervoso centrale, Lumelsky et al. hanno ipotizzato che le strategie in grado d’indurre la produzione da parte di cellule ES di cellule neurali potrebbero essere adattate per l’induzione delle cellule pancreatiche endocrine. La nestina, una proteina filamentosa viene espressa dalle cellule ES neurali durante la differenziazione neurale ed anche nel sottoinsieme dei precursori pancreatici immaturi, negativi all’ormone che, nella differenziazione in vitro, danno origine a cellule che esprimono insulina e glucagone. Lumelsky et al. perfezionarono un protocollo di lavoro che iniziava aumentando la popolazione delle cellule positive alla nestina, la popolazione delle cellule derivate dai corpi embrioidi. I corpi embrioidi sono strutture che comprendono uno strato interno d’ectoderma a forma di colonna che circonda una specie di cavità proamniotica ed uno strato esterno d’endoderma primitivo. La popolazione arricchita di nestina è stata poi espansa in un terreno di coltura senza siero in presenza di FGF (fattore di crescita dei fibroblasti). Dopo il prelevamento di questo mitogene dal mezzo di coltura per ridurre gli stimoli per la divisione cellulare furono aggiunti, altri fattori, come la nicotinamide, precedentemente conosciuta per la sua utilità nel guidare la differenziazione e/o la proliferazione dei precursori trovati nelle cellule pancreatiche fetali. Come risultato si ottenne la produzione d’agglomerati di cellule che esprimevano insulina. Tuttavia, simili manipolazioni non sono riuscite a produrre un fenotipo endocrino pancreatico nelle cellule selezionate positive alla nestina, cellule che sembra contribuiscano alla extra ed intra microvascolarizzazione delle isole piuttosto che alle cellule del pancreas stesso che producono l’ormone. Questi risultati sono stati criticati anche per il fatto che queste cellule in coltura possono effettivamente concentrare dal terreno di coltura l’insulina che sembrano aver prodotto. Delle risposte definitive si possono ottenere ripetendo gli stessi esperimenti con le cellule ES che trasportano i geni reporter fluorescenti transgenici controllati dal fattore di crescita dell’insulina.

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Il potenziale delle cellule staminali adulte

Mentre l’approccio sopra discusso intende ricreare, utilizzando strati di cellule nutrici specifiche e fattori di crescita conosciuti, un ambiente simile a quello esistente in vivo e vuole facilitare inoltre e guidare un tipo di differenziazione cellulare, in un altro studio l’approccio era quello di isolare in vitro delle cellule staminali adulte pluripotenti prelevate da ogni fonte trattabile (es. midollo osseo) e d’introdurre fisicamente queste cellule nell’ambiente idoneo, già esistente dei recipienti viventi. I precursori ricevendo dei segnali ristretti nel tempo e nello spazio dall’ambiente possono differenziarsi in cellule costituenti quello specifico tessuto bersaglio. Lagasse et al. trassero grandi vantaggi da quest’approccio quando generarono con successo degli epatociti in vivo da HSC (cellule staminali umane) purificate. Utilizzando un cocktail d’anticorpi specifici in grado di riconoscere una combinazione di marker di superficie cellulare distinti su una singola cellula, gli autori isolarono fisicamente le HSC dal midollo osseo e le trapiantarono nei topi privi di fumarilacetoacetato idrolisi, un modello animale con una forma fatale di tirosinemia ereditaria di tipo 1. La funzione epatica fu riportata quasi nella norma in 4 dei 9 topolini mutanti, quando, 3 settimane dopo il trapianto, il trattamento standard a base di 2-1,3-cicloexanedione fu interrotto, e questi topolini sopravvissero per altri 6 mesi senza segni d’insufficienza epatica progressiva o danno tubulare renale. Quando l’esperimento fu interrotto dopo 7 mesi dal trapianto, il 30-50% della massa epatica presentava delle cellule che esprimevano i marker derivati dal donatore. Ugualmente, trasferendo i precursori nel cervello di un topo recipiente, Weimann et al. furono capaci di veder purificate le HSC differenziate nei neuroni Purkinje. Come le HSC, una volta transdotte con un retrovirus per esprimere la proteina morfogenica ossea 4 (BMP4), i precursori delle cellule derivate dai muscoli furono in grado di migliorare notevolmente la guarigione di una frattura ossea irreparabile spontanea. Questi dati suggeriscono che i segnali inviati attraverso i contatti cellula a cellula sono potenti abbastanza da guidare i precursori trapiantati a differenziarsi nello stesso tipo di cellule che li circondano, anche attraverso differenti lineage. Questa capacità di transdifferenziarsi costituì certamente, al tempo della pubblicazione, una scoperta strabiliante. Nessuno aveva mai affermato prima d’allora che la cellula staminale di un mammifero, presente in un individuo adulto, poteva possedere una tale duttilità. La possibilità che nuove cellule ß possano essere generate da cellule staminali adulte isolate dai tessuti appartenenti ad altri lineage è particolarmente interessante, poichè eviterebbe i possibili problemi etici associati all’uso delle cellule ES. Tuttavia, gli stessi autori, che in origine avevano proposto i processi di transdifferenziazione per spiegare i loro risultati, realizzarono presto che parte dei sensazionali dati che interpretarono come risultati di un efficiente processo di transdifferenzizione erano più probabilmente il risultato di una fusione cellula a cellula. Altri hanno sostenuto che non tutti i risultati utilizzati per sostenere le capacità di transdifferenzizione delle cellule staminali adulte dovevano essere messe da parte o potevano essere spiegate dalla sola teoria della fusione cellulare. Ianus et al. intitolarono deliberatamente il loro articoli “derivazione in vivo delle cellule endocrine pancreatiche glucosio competenti da midollo osseo senza prova di fusione cellulare”. Malgrado tutto, è probabilmente utile considerare la possibilità di forzare realmente la fusione delle cellule precursori trapiantate con le cellule danneggiate del recipiente come un mezzo di produzione di nuove cellule funzionali, anche se il pancreas endocrino sembra essere un ambiente difficile da raggiungere fisicamente in vivo.

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Il potenziale della terapia genica

Invece di promuovere la fusione cellula a cellula facendo uno sforzo per ristabilire le funzioni fisiologiche andate perse con la morte delle cellule specifiche, è stato considerato più efficiente transfettare le cellule appartenenti ad un certo lineage con geni in grado di convertirle in cellule con le caratteristiche di quelle perse, anche se appartenenti ad un lineage completamente diverso. In particolare, nel campo della ricerca sul diabete, cellule intestinali K nei topi furono indotte a produrre insulina umana attraverso la transfettazione del gene dell’insulina umana collegato ai 5’ della regione regolatoria del gene che codifica il polipeptide insulinotropico glucosio dipendente (GIP). Inoltre, la dimostrazione che gli epatociti transfettati con il gene Pdxl sotto controllo del promotor l dell’insulina dei topolini erano in grado di produrre insulina, attrasse particolarmente l’attenzione creando nuove speranze. In questi studi, furono secreti livelli d’insulina sufficienti a soddisfare il fabbisogno nei topi diabetici, che, quando trattati, diventavano e restavano euglicemici. Questi studi, tuttavia, non sono ancora stati ripetuti con successo da altri gruppi.

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I problemi futuri

La capacità di clonare embrioni umani e creare da queste linee cellulari ES umane è già una realtà. Anche se un domani gli scienziati potrebbero produrre, attraverso la clonazione, delle linee cellulari in grado di differenziarsi in cellule con il fenotipo di una cellula ß ed in numero sufficiente per soddisfare la quantità necessaria per un trapianto nei pazienti diabetici, affinchè queste cellule possano essere utilizzate per scopi clinici, dovrebbero possedere il genoma diploide dei nuclei cellulari somatici derivati dagli individui non correlati al donatore dell’ovocita, ad esempio, quelli del recipiente. Inoltre, dovremmo anche isolare da ogni paziente la propria linea cellulare staminale o sviluppare una banca di linee cellulari rappresentanti la vasta diversità dei polimorfismi MHC (complesso maggiore d’istocompatibilità) umani in modo da evitare l’allorigetto. In queste circostanze, tuttavia, la presenza dell’autoimmunità desterà ancora preoccupazione. Se si sceglie di evitare quest’arduo sforzo preparativo di trovare un donatore compatibile per il recipiente, sarà necessario ridurre le probabilità dell’allorigetto attraverso altri mezzi. Questo obiettivo potrebbe essere più semplice da raggiungere utilizzando delle cellule ES piuttosto che ogni altra cellula adulta per il trapianto, poichè le linee cellulari ES appena studiate sembrano in grado di sottoregolare l’espressione degli antigeni MHC alla superficie. è da notare, tuttavia, che queste cellule dividendosi rapidamente con quest’unico fenotipo devono fermare la loro crescita spontaneamente una volta raggiunta una massa cellulare specifica e predeterminata della popolazione totale, poichè sembrano non essere controllate dalle cellule NK. Inoltre, anche sostenendo che potremmo vincere queste sfide, l’utilizzo delle linee cellulari ES umane create su misura per ogni individuo costituirebbe un proposito costoso ed estremamente impegnativo. Probabilmente sarebbe altrettanto impegnativo utilizzare dei mezzi diversi dal trapianto di midollo per evitare la risposta autoimmune. Tuttavia, sono state già proposte alcune strategie promettenti, probabilmente più adatte per applicazioni terapeutiche che per il trapianto di midollo. Una volta affinate, queste potrebbero favorire il ristabilimento di un tollerante stato immunitario che libererebbe il paziente dall’attacco protratto delle cellule T contro le loro strutture cellulari ß e di conseguenza dalla pesante terapia immunosoppressiva anche quando sono state trapiantate cellule secernenti insulina MHC compatibili. Anche affermando che l’autoimmunità può essere superata, i trattamenti basati sulla rigenerazione richiederebbero anche che si determinasse il lasso di tempo in cui è possibile sfruttare il potenziale rigenerativo delle cellule ß e la caratterizzazione di possibili fattori scatenanti che permetterebbe di evitare i limiti quantitativi e cronologici.

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Conclusioni

I giovani pazienti diabetici devono controllare i loro livelli di glucosio presenti nel sangue e devono iniettarsi insulina almeno 4 volte al giorno. Contemporaneamente, vivono con la costante minaccia d’incidenti conseguenti a crisi ipoglicemiche acute e all’onnipresente preoccupazione per le complicanze croniche. Sebbene la ricerca sulle cellule ES umane porti con se un enorme potenziale scientifico per il trattamento e la possibile cura di molte malattie, in un prossimo futuro, i progressi nell’ambito dell’immunoregolazione potrebbero precedere quelli del settore delle cellule staminali. Trovare strade sicure per bloccare l’autoimmunità è il primo obiettivo fondamentale da raggiungere per dare ai pazienti una soluzione affidabile alla loro pesante condizione cronica, poichè si tratta di un prerequisito indispensabile sia per l’utilizzo efficiente della terapia basata sulle cellule ES sia per il ristabilimento dell’euglicemia secondo il percorso rigenerativo pancreatico.

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Fonte: J Clin Invest. 115:5-12 (2005)
Traduzione e adattamento a cura di Linda Possanzini
Data ultimo aggiornamento: Giovedì, 10 Febbraio 2005 10:53:00

URL: http://www.progettodiabete.org/expert/e1_225.html

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