Sviluppo di sistemi non virali (DNA nudo) per la terapia genica del Diabete Mellito di Tipo I
di Francesca Mingozzi
Unità di Medicina Interna, Diabetologia ed Endocrinologia
Istituto San Raffaele Telethon di Terapia Genica
Università Vita-Salute, H.San Raffaele, MilanoQuesta parte del progetto ‘Terapia Genica del Diabete Mellito’ si propone di sviluppare metodi di trasferimento genico basati sull’utilizzo di DNA elementare o "nudo", privo cioè di qualunque elemento di rivestimento di origine cellulare o virale. In questo modo il DNA non risulta tossico, e non dà origine ad alcuna risposta immunitaria che, invece, può insorgere a seguito dell’utilizzo di vettori derivati da virus. Il limite dell’utilizzo del DNA ‘nudo’ è però la necessità di facilitarne l’ingresso nelle cellule impiegando un metodo fisico, come un campo elettrico o un aumento di pressione.
Per inserire il DNA nelle cellule del fegato abbiamo utilizzato il metodo dell'idrodinamica, ossia un'iniezione endovenosa (nel topo nella vena della coda) di DNA risospeso in un elevato volume di soluzione fisologica. Questa semplice tecnica permette un'alta efficienza di trasferimento genico, grazie ad un transitorio aumento di pressione all’interno delle vene del fegato.
In effetti, iniettando il gene dell'insulina inserito all’interno di un piccolo segmento di DNA di origine batterica, usato negli esperimenti di biologia molecolare e definibile come plasmide convenzionale, abbiamo ottenuto alti livelli d'espressione nei giorni successivi all'iniezione, tali da normalizzare la glicemia in animali diabetici per circa una settimana. Tuttavia abbiamo osservato un rapido decremento dei livelli d’ insulina già dopo la prima settimana, fino alla sua successiva scomparsa. Abbiamo allora ipotizzato che questa rapida diminuzione fosse causata dalla prevalente presenza di DNA batterico e dalle ridotte dimensioni del plasmide. Per questo motivo abbiamo costruito un vettore non-virale che contiene una lunga sequenza di DNA umano. Questo plasmide è stato definito plasmide genomico. L’iniezione del plasmide genomico ha portato alla sintesi di elevati livelli di insulina, capaci di ottenere la correzione della glicemia in animali diabetici per circa una settimane, e dopo un iniziale decremento, nel mantenimento di livelli insulinemici basali per almeno 8 settimane. Questi livelli basali d'espressione si sono dimostrati sufficienti a ridurre la severità del diabete ed aumentare la percentuale di sopravvivenza dei topi diabetici. Da questi risultati possiamo dedurre che 1) l’introduzione di una sequenza di DNA genomico umano in un plasmide, prolunga significativamente il tempo d'espressione del gene dell'insulina. 2) Il ripristino di livelli basali d’insulina mediante trasferimento genico migliora il diabete e la sopravvivenza in questo modello animale di diabete.
A questo punto abbiamo introdotto nel plasmide genomico una sequenza di DNA capace di attivarsi in risposta al glucosio (promotore glucosio-inducibile), per regolare la produzione d'insulina in risposta alle variazioni glicemiche. I primi risultati sono stati incoraggianti, in quanto abbiamo potuto osservare un significativo aumento dei livelli d'insulina dopo 5 ore dalla stimolazione con il glucosio ed una conseguente diminuzione di glicemia. La risposta alle variazioni glicemiche sembra però essere ancora lenta, rispetto alle variazioni glicemiche nell’uomo; per questo motivo sarà necessario testare altri promotori che rispondano più velocemente allo stimolo di glucosio. Questa fase iniziale del progetto, ci ha permesso di stabilire che il trasferimento genico attraverso plasmidi genomici rappresenta un metodo per gli studi di regolazione.
I programmi futuri saranno quelli di valutare la durata e l’efficacia a lungo termine della produzione d'insulina ottenuta utilizzando DNA genomico umano. Vogliamo inoltre utilizzare questa procedura per studiare altri costrutti glucosio-regolati, in modo da identificare un promotore capace di fornire una rapida risposta insulinica, in grado di controllare precisamente i livelli glicemici.
Fonte: A.A.G.D. Associazione per l’Aiuto ai Giovani Diabetici – ONLUS (Milano) - Riunione di inizio anno (15/2/2003)
Data ultimo aggiornamento: Martedì, 25 Marzo 2003 6:30:00
URL: http://www.progettodiabete.org/expert/e1_194.html
